Enzim restriksi adalah enzim yang memotong DNA pada tempat-tempat tertentu. Enzim ini bekerja pada atau di dekat urutan nukleotida pengenalan spesifik yang dikenal sebagai "situs restriksi". Untuk memotong DNA, semua enzim restriksi membuat dua sayatan, sekali melalui setiap untai heliks ganda DNA.
Enzim-enzim ini ditemukan pada bakteri dan archaea dan mempertahankannya dari serangan virus, yang merupakan bakteriofag.
Di dalam prokariota, enzim restriksi secara selektif memotong DNA asing dalam proses yang disebut restriksi. DNA inang dilindungi oleh enzim lain yang melindungi DNA inang dan menghalangi pembelahan. Bersama-sama, kedua proses ini adalah sistem modifikasi restriksi. Ini adalah sistem kekebalan paling awal dan paling sederhana. Mereka juga semacam elemen genetik seluler yang egois.
Lebih dari 3000 enzim restriksi telah dipelajari secara rinci, dan lebih dari 600 di antaranya tersedia secara komersial. Enzim-enzim ini secara rutin digunakan untuk modifikasi DNA di laboratorium, dan merupakan alat vital dalam kloning molekuler.