Pada tahun 1606, Smith disewa oleh Virginia Company untuk menetap di Koloni Virginia untuk mendapatkan keuntungan. Mereka berlayar dengan tiga kapal, pada bulan Desember 1606. Smith memiliki seorang pelayan bernama Samuel Collier. Samuel Collier akan tinggal bersamanya hampir sepanjang perjalanan.
Ada masalah dalam pelayaran dan Smith didakwa melakukan pemberontakan. Kapten Newport berencana untuk mengeksekusinya. Kapten membuka surat perintah dari Virginia Company yang menyatakan bahwa Smith akan menjadi salah satu pemimpin koloni baru, sehingga Smith tidak dibunuh.
Inggris tiba pada bulan April 1607 dan Kapten Wingfield memilih Jamestown sebagai lokasi koloni. Pada musim panas para pemukim masih tinggal di perumahan sementara. Setelah perjalanan laut selama empat bulan, persediaan makanan hanya cukup bagi setiap orang untuk mendapatkan satu atau dua cangkir makanan gandum per hari. Karena cuaca dan kurangnya makanan, penyakit menyebar ke seluruh penduduk dan pada bulan September, lebih dari setengahnya meninggal.
Pada bulan Desember 1607, Smith sedang mencari makanan dan ditangkap oleh penduduk asli Amerika. Dia dibawa untuk bertemu dengan Kepala Suku Powhatan. Desa itu berjarak sekitar 15 mil dari Jamestown. Smith dibebaskan tanpa cedera dan memberikan pujian sebagian kepada putri kepala suku, Pocahontas, yang melemparkan dirinya ke tubuhnya. Melihat hal ini, ayahnya berbelas kasihan pada Smith dan dia dengan aman dibawa kembali ke Jamestown. Pertemuan ini memulai hubungan persahabatan antara penduduk asli, Smith, dan para kolonis di Jamestown. Pada awal Januari 1608, hampir 100 pemukim baru tiba bersama Kapten Newport, dan karena kecerobohan, desa itu dibakar. Musim dingin itu Sungai James membeku, dan para pemukim terpaksa tinggal di reruntuhan. Selama masa ini, Newport dan krunya membuang banyak waktu untuk memuat kapal mereka dengan pirit besi (emas bodoh). Persediaan makanan menipis dan meskipun penduduk asli Amerika membawa beberapa makanan, Smith menulis bahwa "lebih dari separuh dari kami meninggal."
Pada bulan April 1608 sebuah kapal membawa perbekalan dan 50 pemukim baru, yang oleh Smith diatur untuk membangun perumahan dan bercocok tanam.
Pada musim panas tahun 1608, Smith meninggalkan Jamestown untuk menjelajahi wilayah Chesapeake Bay dan mencari makanan yang sangat dibutuhkan. Dia membuat peta yang akan sangat berharga bagi para penjelajah Virginia selama lebih dari satu abad. Saat dia tidak ada, Smith meninggalkan temannya Matthew Scrivener, sebagai gubernur menggantikannya. Scrivener kemudian tenggelam dalam badai dalam pelayaran naas ke Hog Island. Smith terpilih sebagai presiden dewan lokal pada bulan September 1608 dan menerapkan aturan yang ketat.
Pada bulan Oktober 1608, sebuah kapal tiba dengan 70 pemukim baru, termasuk wanita pertama. Beberapa pengrajin Jerman dan Polandia juga tiba, tetapi mereka tidak membawa persediaan makanan. Setelah itu, Smith mencoba mendapatkan makanan dari penduduk asli Amerika dan butuh ancaman kekuatan militer agar mereka mematuhinya. Powhatan takut dengan banyaknya orang kulit putih yang datang ke daerah itu dan berusaha membuat mereka kelaparan.
Smith mendapati bahwa ada orang-orang di antara para pemukim dan penduduk asli Amerika yang tidak menyukai peraturannya dan berencana untuk membunuhnya. Smith menulis bahwa dia diperingatkan oleh Pocahontas. Dia mengadakan pertemuan dan mengatakan kepada orang-orang yang tidak bekerja bahwa "siapa yang tidak mau bekerja tidak akan makan..." Setelah itu situasi membaik.
Selama tiga bulan di awal tahun 1609, Februari, Maret dan April, semua berjalan dengan baik di Jamestown dengan banyak tempat tinggal yang dibangun, berhektar-hektar tanah yang dibuka dan banyak pekerjaan lain yang dilakukan. Kemudian pada bulan April, tikus dan kelembaban menghancurkan semua jagung yang mereka simpan. Mereka sangat membutuhkan makanan dan Smith mengirim sekelompok besar pemukim untuk menangkap ikan dan yang lainnya mengumpulkan kerang-kerangan di hilir sungai. Mereka kembali tanpa makanan dan cukup bersedia untuk mengambil jatah yang sedikit yang ditawarkan kepada mereka. Hal ini membuat Smith marah dan dia memerintahkan mereka untuk menukar senjata dan peralatan mereka dengan buah dari orang Indian dan memerintahkan semua orang untuk bekerja atau mereka harus meninggalkan benteng yang aman. Beberapa pergi dan pergi ke desa-desa penduduk asli Amerika, tetapi orang-orang Powhatan juga mengikuti hukum Smith bahwa siapa yang tidak bekerja, tidak makan. Ini berlaku sampai mereka hampir kelaparan dan mereka kembali ke rumah.
Pada suatu saat sebuah kapal yang tidak terduga tiba, dikapteni oleh Samuel Argall. Dia membawa makanan dan anggur yang dibeli Smith dengan janji untuk membayar kembali. Argall juga membawa berita bahwa Perusahaan Virginia mengirim lebih banyak persediaan dan pemukim ke Jamestown bersama dengan gubernur baru, Lord De la Warr.
Dalam pelayaran ke Virginia pada bulan Mei 1609, Sir Thomas Smith, bendahara Virginia Company, mengatur sekitar 500 kolonis, termasuk wanita dan anak-anak untuk ikut serta. Sebuah armada yang terdiri dari sembilan kapal berlayar. Satu kapal tenggelam dalam badai segera setelah meninggalkan pelabuhan. Sea Venture karam di kepulauan Bermuda dengan laksamana dan Stephen Hopkins di dalamnya. Satu tahun kemudian, pada bulan Mei 1610, mereka tiba di Jamestown dengan perahu kecil yang mereka buat. Gates segera menemukan bahwa tidak ada cukup makanan untuk menghidupi semua orang di koloni dan memutuskan untuk meninggalkan Jamestown. Ketika perahu mereka meninggalkan daerah Jamestown, mereka bertemu dengan sebuah kapal yang membawa gubernur baru, Lord De la Warr, yang memerintahkan mereka kembali ke Jamestown.
Pada bulan Agustus 1609 John Smith cukup terkejut melihat lebih dari 300 pemukim baru tiba. London mengirim pemukim baru tanpa perencanaan tentang bagaimana atau di mana mereka akan tinggal.
Kapten John Smith terluka parah akibat ledakan bubuk mesiu yang tidak disengaja di sampannya. Smith berlayar ke Inggris untuk perawatan pada bulan Oktober 1609. Dia telah menghabiskan dua setengah tahun mencoba melakukan yang terbaik untuk Jamestown. Dia tidak pernah kembali ke Virginia. Sejarah telah mengukuhkan kontribusi besarnya di Jamestown pada tahun-tahun awalnya.
Para kolonis akan terus meninggal karena berbagai penyakit dan penyakit, dengan perkiraan 150 dari 500 orang yang bertahan hidup pada musim dingin itu. Meskipun demikian, Virginia Company terus membiayai dan mengangkut para pemukim untuk mempertahankan Jamestown. Selama lima tahun berikutnya, Gubernur Gates dan Sir Thomas Dale terus menjaga disiplin yang ketat, dengan Sir Thomas Smith di London berusaha mencari pengrajin terampil dan pemukim lain untuk dikirim ke Jamestown.