Permainan dimulai dengan Chell terbangun di sebuah ruangan kaca kecil yang hanya memiliki tempat tidur, toilet, dan radio di dalamnya. Dia diberitahu oleh GLaDOS bahwa pengujian akan segera dimulai, dan portal oranye terbuka di salah satu dinding. Setelah pemain melewatinya, dia memasuki ruang pengujian dan memulai pengujian. Ada 20 ruang pengujian, yang disebut Test Chambers, secara keseluruhan.
Tesnya dimulai dengan sederhana. Chell harus mengambil kotak-kotak, yang disebut Weighted Storage Cubes (disingkat Cubes), dan menaruhnya pada tombol, yang akan membuka pintu keluar ruangan. Pada titik ini, GLaDOS berbicara kepada Chell sebagai pemandu, memujinya, dan menjanjikannya kue ketika tes selesai. Menjelang awal permainan, Chell mendapatkan Perangkat Portal Genggam Aperture Science, juga dikenal sebagai Portal Gun. Pada awalnya, Portal Gun-nya hanya membuat portal biru dan portal oranye dibuat oleh GLaDOS. Kemudian, Chell mendapatkan Portal Gun lengkap dan dapat membuat portal biru dan oranye.
Tes menjadi semakin berbahaya semakin jauh ke dalam permainan. Di beberapa ruangan, ada racun di lantai. Di ruangan lain, ada bola-bola listrik yang disebut High Energy Pellets yang akan membunuh Chell jika dia menyentuhnya. Selama tes-tes ini, GLaDOS menjadi semakin sarkastik, memberikan saran yang tidak berguna kepada Chell, seperti "Lantai di sini akan membunuhmu. Cobalah untuk menghindarinya." Pada satu titik, GLaDOS memberi tahu Chell bahwa sebuah ruangan rusak dan dia harus melalui ruangan yang penuh dengan senjata penjaga, yang disebut Turret, sebagai gantinya. Jika Turret melihat Chell, Turret akan menembaknya sampai dia mati. Di dalam ruangan ini terdapat ruang tersembunyi. Di ruang tersembunyi terdapat gambar dan tulisan di dinding yang ditinggalkan oleh orang yang tidak dikenal. Tulisan itu mengatakan hal-hal seperti "kue itu bohong" dan "dia selalu mengawasi" dengan gambar kamera. Ada lebih banyak ruangan seperti ini di ruang-ruang selanjutnya.
Di ruang lain, Chell harus menggunakan Weighted Companion Cube, yang terlihat seperti Weighted Storage Cube dengan hati di atasnya, untuk menyelesaikan tes. Selama tes, GLaDOS memberi tahu Chell beberapa kali bahwa Companion Cube tidak hidup, tetapi di akhir tes, dia memberi tahu Chell bahwa dia harus "membunuh" Companion Cube untuk melanjutkan ke tes berikutnya.
Selama tes terakhir, Chell harus berdiri di atas platform yang bergerak. Di ujung jalur platform, platform itu akan membawanya ke dalam lubang api. GLaDOS berterima kasih kepada Chell karena telah melakukan tes. Di menit-menit terakhir, Chell menggunakan Portal Gun-nya untuk lolos dari jebakan. Saat mencoba melarikan diri dari gedung, Chell dibawa ke sebuah ruangan di mana dia menemukan GLaDOS. Chell memecahkan bola putih yang jatuh dari GLaDOS. GLaDOS mengatakan padanya bahwa dia bodoh untuk memecahkannya karena mereka tidak tahu apa itu, tetapi GLaDOS dengan cepat mengetahui bahwa itu adalah inti moralitasnya. Dia memberi tahu Chell bahwa orang-orang yang bekerja untuk Aperture Science memasangnya untuk membuatnya berhenti membunuh mereka dengan "Deadly Neuro-Toxin". Karena Chell melanggarnya, GLaDOS dapat menggunakan Neuro-Toxin lagi. Chell memiliki batas waktu 6 menit untuk membunuh GLaDOS sebelum Neuro-Toxin membunuh Chell. Setelah mematahkan potongan-potongan tubuhnya dan membakarnya, GLaDOS hancur dan Chell melarikan diri dari gedung.
Setelah Chell melarikan diri, dia pingsan, dan sebuah robot menyeretnya kembali ke dalam gedung. Selama kredit, GLaDOS menyanyikan lagu berjudul "Still Alive" yang ditulis oleh Jonathan Coulton, yang mengatakan bahwa meskipun Chell membunuhnya, dia masih hidup.
