Sekitar tahun 1000 SM, sekelompok besar orang menetap di daerah ini. Mereka adalah orang-orang Umbria. Mereka tinggal di desa-desa kecil berbenteng di dataran tinggi. Dari tahun 450 SM, desa-desa Umbria diambil alih oleh bangsa Etruria. Kemudian bangsa Romawi menguasai Italia tengah melalui Pertempuran Sentinum pada tahun 295 SM. Mereka meratakan sebagian tanah dalam bentuk teras-teras (undakan-undakan lebar) dan membangun sebuah kota besar bernama Asisium di sisi Gunung Subasio. Kota ini menjadi Asisi. Beberapa bangunan masih dapat dilihat dari zaman Romawi di Assisi. Bangunan-bangunan ini termasuk tembok, piazza utama, dan Kuil Dewi Minerva, yang sekarang menjadi gereja bernama Santa Maria sopra Minerva.
Pada tahun 238 Masehi, semua orang Asisi menjadi Kristen, karena ajaran Uskup Rufino. Ia menjadi martir. Dipercaya bahwa tubuhnya dimakamkan di bawah Gereja Katedral San Rufino di Assisi.
Ostrogoth dari raja Totila menghancurkan sebagian besar kota pada tahun 545. Kemudian Assisi dikuasai oleh Lombard, yang datang dari utara Italia, dan kemudian oleh penguasa Frank.
Pada abad ke-11 (1000-an), Assisi menjadi kota yang bebas. Tetapi ada pertempuran terus-menerus antara dua kelompok yang disebut Ghibellines dan Guelphs. Assisi terutama mendukung Ghibellines, tetapi kota besar terdekat, Perugia, mendukung Guelphs. Selama pertempuran Ponte San Giovanni (Jembatan Santo Yohanes), Guelph dari Perugia berhasil menangkap seorang pemuda dari Assisi. Namanya Francesco di Bernardone. Sebagian karena pengalamannya ketika ia ditangkap, Francesco muda memutuskan bahwa ia akan berubah dari seorang tentara. Ketika ia kembali ke rumah ayahnya, ia menyingkirkan semua kekayaannya dan menjadi pengkhotbah yang miskin dan mengembara, memberitahu orang-orang untuk berbalik kepada Tuhan dan hidup damai dengan satu sama lain. Ia bekerja dengan orang-orang miskin dan orang-orang yang terbuang. Mereka tidak memiliki gereja kecuali sebuah reruntuhan. Santo Fransiskus dan teman-temannya membangun kembali gereja kecil yang hancur untuk para gembala dan orang-orang miskin lainnya untuk beribadah. Gereja itu disebut "Porziuncola". Francesco (Fransiskus) mendirikan Ordo Fransiskan. Dia "dikanonisasi" (dijadikan orang suci) pada tahun 1228 dan dikenal sebagai Santo Fransiskus. Dia adalah salah satu orang suci yang paling populer.
Sebuah gereja basilika besar dibangun di sisi gunung, untuk menghormati Santo Fransiskus, dan dihiasi dengan indah dengan adegan-adegan kehidupannya. Salah satu adegan yang paling terkenal menunjukkan kisah Santo Fransiskus berkhotbah kepada burung-burung. Pada tahun 1997 Assisi dilanda dua gempa bumi. Sebagian atap basilika jatuh, menewaskan empat orang yang berdiri di bawahnya, dan merusak langit-langit yang dicat. Banyak orang "memberikan sumbangan" (memberi uang) untuk memperbaiki bangunan yang dibuka kembali kurang dari dua tahun kemudian.