Otho, yang merupakan kekasih Poppea, kembali ke rumahnya dan mendapati bahwa kaisar Nero berada di rumahnya untuk menghabiskan malam bersama Poppea. Para penjaga Nero telah mengepung rumah itu. Nero mengatakan kepada Poppea bahwa dia harus pergi sekarang, tetapi dia mencintainya dan akan segera kembali. Ketika dia pergi, Arnalta, perawat Poppea, memperingatkannya bahwa perselingkuhannya dengan Nero akan membawa masalah. Octavia, istri Nero, sangat sedih karena suaminya berselingkuh dengan orang lain dan berharap para dewa akan menghukumnya. Perawatnya menghiburnya, mengatakan bahwa dia harus menemukan kekasih baru untuk membuat Nero berseberangan, tetapi Octavia terlalu terhormat untuk melakukan hal seperti itu. Filsuf Seneca mengatakan kepadanya bahwa dia harus menerima nasibnya. Anak halaman mengatakan bahwa filsuf itu bodoh.
Nero memberi tahu Seneca bahwa dia akan menyingkirkan istrinya dan menikahi Poppea. Seneca memperingatkan Nero bahwa rakyat tidak akan menyukai hal ini, tetapi Nero tidak peduli. Dia adalah kaisar dan dapat melakukan apa yang dia suka. Nero mengatakan kepada Poppea bahwa dia sangat mencintainya sehingga dia ingin menjadikannya permaisuri. Poppea mengatakan kepada Nero bahwa Seneca percaya bahwa Nero hanya kuat karena dia (Seneca) dapat membimbingnya. Nero segera mempercayainya dan mengatakan Seneca harus dibunuh. Otho telah menyaksikan adegan ini. Dia pergi ke Poppea dan mencoba untuk mendapatkan cintanya kembali, tetapi Poppea mengatakan bahwa dia milik Nero sekarang. Otho menyadari bahwa Poppea hanya menginginkan kekuasaan, dan dia tahu bahwa Nero akan memerintahkannya untuk dibunuh ketika dia tahu bahwa dia dulunya adalah kekasih Poppea, jadi dia memutuskan dia harus membunuh Poppea.
Otho pergi ke Drusilla yang jatuh cinta padanya. Dia mengatakan kepadanya bahwa dia mencintainya, tetapi dia diam-diam mengatakan bahwa Poppea masih ada di dalam hatinya.
Babak II
Dewa Merkurius memperingatkan Seneca bahwa ia akan mati. Seneca cukup senang dengan berita itu, karena itu berarti ia akan hidup bersama para dewa di surga. Liberto, seorang utusan (namanya berarti "budak yang dibebaskan"), datang untuk memberitahu Seneca bahwa Nero akan membunuhnya. Dia terkejut ketika Seneca sudah tahu. Ada adegan singkat di mana Page menggoda Lady-in-Waiting. Nero, dengan temannya Lucan, bernyanyi memuji Poppea.
Octavia menyuruh Otho untuk menyamar dengan pakaian wanita dan pergi membunuh Poppea. Dia mengatakan bahwa dia akan memberi tahu Nero hal-hal buruk tentang dia jika dia tidak melakukannya. Ada adegan komik antara Halaman dan Perawat. Drusilla membiarkan Otho meminjam pakaiannya untuk menyamar. Poppea berada di kebunnya yang sedang ditidurkan oleh Arnalta. Cupid menyanyikan sebuah lagu, berjanji untuk melindunginya. Ketika Otho, yang menyamar sebagai Drusilla, datang untuk membunuhnya, Cupid menghentikannya.
Babak III
Drusilla senang karena saingannya akan mati. Para penjaga segera menangkapnya karena berpikir bahwa dia mencoba membunuh Poppea (sebenarnya Otho yang menyamar). Drusilla menyadari bahwa dia bodoh meminjamkan pakaiannya kepada Otho. Dia memberi tahu Nero bahwa dia bersalah. Otho kemudian berbicara dan memberi tahu Nero apa yang terjadi. Nero menghukumnya dengan menyuruhnya meninggalkan Roma dan pergi dan tinggal di padang gurun yang jauh. Nero juga menyuruh Octavia pergi dari Roma. Dia mengatakan bahwa Octavia harus dimasukkan ke dalam perahu dan ditinggalkan begitu saja. Octavia menyanyikan lagu perpisahan untuk Roma. Arnalta menyanyikan lagu komik tentang betapa pentingnya dia sekarang sebagai perawat permaisuri. Opera ini diakhiri dengan duet cinta yang indah untuk Nero dan Poppea.