Interstate 81 adalah jalan antar negara bagian utara-selatan di Amerika Serikat bagian timur. Membentang dari Dandridge, Tennessee di selatan ke Wellesley Island, New York di utara; untuk jarak total sekitar 854,89 mil (1.375,81 km). Jalur ini mengikuti Pegunungan Appalachian hampir di seluruh panjangnya.

Interstate 81 dimulai di Tennessee di Interstate 40 di Dandridge. Rute ini mengikuti Pegunungan Appalachian untuk sebagian besar rutenya melalui Tennessee dan Virginia, melayani kota-kota seperti kota kembar Bristol, Tennessee dan Bristol, Virginia, Roanoke, Blacksburg, Lexington, Staunton, Harrisonburg, dan Winchester. Di Harrisonburg, I-81 memotong kampus Universitas James Madison. Jalan ini mengikuti jalur yang lebih tua, U.S. Route 11, untuk seluruh panjangnya di Virginia.

Interstate 81 secara singkat memasuki panhandle timur Virginia Barat, melayani kota Martinsburg. Kemudian melintasi negara bagian Maryland di salah satu titik tersempitnya, melewati "Hub City" Hagerstown di mana ia melintasi banyak rute lainnya.

Interstate 81 membentuk koridor utama utara-selatan melalui negara bagian Pennsylvania, melayani borough Chambersburg dan Carlisle, di mana ia bertemu dengan Pennsylvania Turnpike. Tetapi I-81 tidak secara langsung bersimpangan dengannya (pengendara harus menggunakan US 11 untuk menghubungkannya). Di sekitar ibukota negara bagian Harrisburg, rute ini membentuk bagian timur laut dari Capital Beltway Pennsylvania. Rute ini kemudian bergerak ke timur laut menuju Lembah Wyoming, di mana rute ini melayani kota-kota Wilkes-Barre dan Scranton, kemudian menuju ke utara melalui wilayah Pegunungan Tak Berujung menuju garis negara bagian. Meskipun ditandatangani sebagai jalan raya utara-selatan, namun jelas timur laut-barat daya dan kadang-kadang timur-barat di seluruh negara bagian.

Interstate 81 memasuki negara bagian New York dekat Binghamton. Jalan ini mengikuti U.S. Route 11 dengan arah utara-selatan, melalui sebagian besar negara bagian. Rute ini melayani kota-kota Syracuse (di mana ia bersinggungan dengan New York State Thruway), dan Watertown. Rute ini berakhir di perbatasan Kanada di Jembatan Kepulauan Seribu, di mana ia melintasi Sungai St Lawrence, berlanjut sebagai penghubung pendek, Highway 137, yang melayani Thousand Islands Parkway dan Highway 401.

Koalisi Koridor Interstate 81, koalisi enam negara bagian, diorganisasikan untuk menangani masalah-masalah di sepanjang Interstate 81, seperti lalu lintas truk dan polusi udara. Pada tanggal 15 Oktober 2008, komisi ini telah bertemu dua kali.